ana sayfa    tıp, sağlık, güzellik    kan

yöntemler

1. slide yöntemi
2. tüp yöntemi
3. jel santrifügasyon yöntemi
4. mikroplate yöntemi
5. manual polybrene testi
6. yarı veya tam otomatize sistemler

slide yöntemi

abo ve rhd antijenlerinin hızlı bir biçimde tanımlanmasında kullanılır. eşit oranda antiserum ile parmak ucundan alınan kan veya %20’lik eritrosit süspansiyonu lam veya fayans üstünde çevirme hareketi ile karıştırılır. eritrositlerin kümeler oluşturması, yani aglutinasyon oluşumu gözlenir. tepkime yüzeyi geniş olduğundan buharlaşma fazladır. bu yüzden 1-2 dakika (max.5 dakika) içerisinde değerlendirilmelidir.

tüp aglutinasyon testi

serum fizyolojikle hazırlanan eritrosit süspansiyonu ile antijen bir tüpte karıştırılır. 1000 rpm devirle 1 dakika santrifüge edildikten sonra tekrar süspanse edilir ve aglutinasyon değerlendirilir. bu değerlendirme mikroskopla veya mercekle yapılabilir. alternatif olarak bir damla kan lama alınarak, mikroskopla ufak büyütmede de incelenebilir. fiziksel şartlar ideal olarak hazırlandığında, neticeler olabildiğince güvenilirdir. buharlaşma problemi yoktur. istendiğinde 37 c°’de 1-2 saat inkübe edilebilir. diğer yandan rbc yıkama işlemlerinin fazla olması nedeniyle kontaminasyon ihtimali diğerlerine göre daha fazladır.

jel santrifügasyon yöntemi

jel testi pekçok yönden tüp yöntemine benzer. testte 5x7 cm büyüklüğünde plastik kartlar kullanılır. her kartın üstünde 6 mikrotüp vardır. mikrotüplerin tabanı, değerlendirmeyi kolaylaştırmak için konik; üst kısmı ise, inkübasyon gerektiren testler için daha geniş olarak yapılmıştır. tüplerin içinde sephadex-g 100 maddesini içeren bir jel vardır. bu madde başlangıçta toz halindedir; ancak buffer ile karıştığında jel halini alır. kartlar için jel hazırlanırken, önce buffer ile yıkanarak şişmesi sağlanır. daha sonra da buffer içinde süspansiyonu hazırlanır. kullanılacağı testin özelliğine göre serum fizyolojik veya lıss, buffer olarak kullanılır.

testte vakit ve hız yönünden standardize edilmiş bir santrifüj kullanılıyor. santrifügasyon işlemi, 70x’de 10 dakika yapılır. deneysel çalışmalar, santrifüj ekseninin de önemli olduğunu göstermiştir. dolayısıyla, eksen santrifüj gücü ile düşey ve yatay planda tam bir doğru oluşturmaktadır.

buffer ile yıkama sırasında şişen jel, yalnızca aglutine olmayan rbc’lerin geçişine izin verir. aglutine olmayan eritrositler, santrifüj işlemi sırasında jel tabakasını geçerek, konik kısımda çökerler. aglutine olmuş eritrositler ise üst kısımda kümeler oluştururlar. güçlü aglutinasyonda çok büyük kümeler oluşur ve jel üstünde bir tabaka meydana getirirler. zayıf aglutinasyonda ise ufak kümeler oluşur ve reaksiyonun şiddetini değerlendirmek de kolaylaşmış olur.

mikroplate yöntemi

mikroplate yönteminde u veya v tabanlı plastik 96 godeli mikrotitrasyon plakları kullanılır. eritrosit süspansiyonu u pleyt için %1-2’lik, v pleyt için %0,03 konsantrasyonda hazırlanır. 20 µl antiserum ve 20 µl eritrosit süspansiyonu godeye eklendikten sonra plak, santrifüge edilir. u pleytler çalkalanıp klasik teknikler gibi değerlendirilirken, v tabanlı pleytler 75 c°’de 10 dakika inkübe edildikten sonra değerlendirilir. düşük konsantrasyonda eritrosit kullanıldığı için diğer yöntemlerden daha duyarlıdır. çok az oranda antiserum kullanıldığı için daha ekonomik bir metotdur.

polybrene yöntemi

katyonik bir polimer olan polybrene normal eritrositlerde agregasyona sebep olur. bu agregasyon ortama sodyum sitrat eklendiğinde dağılır. şayet eritrositler antikorlarla kaplanmış ise, polybrene eklendiğinde antikorlar, eritrositler arasında köprü oluşturarak aglutinasyona sebep olur. bu şekilde meydana gelen agregasyon, sodyum sitratla dağılmaz. polybrene, hem manual hem de otomatik sistemlerde mikroplate veya tüpte kullanılabilir. testte yapılacak ilk işlem, eritrosit yüzeyinin antikorlarla kaplanması için eritrosit süspansiyonu ile antiserumu inkübe etmektir. daha sonra ortama polybrene eklenir. agregasyon oluşumu izlenir. santrifügasyon sonrası supernatant uzaklaştırılır ve ortama trisodyum sitrat-dextroz karışımı eklenerek aglutinasyon değerlendirilir.